Die modRNA-LNP-Technologie ein narrativer Review
In unserem aktuellen Preprint „Complexity, unpredictability and safety challenges of lipidnanoparticles“, haben wir die Entwicklung der derzeit verwendeten Lipid-Nanopartikel(LNP)-Formulierungen von ihren konzeptionellen Ursprüngen bis zu den neuesten wissenschaftlichen Erkenntnissen multidisziplinär nachgezeichnet und analysiert.
Wir haben unser Review dazu in verschiedene Unterpunkte aufgeteilt. Da es sehr viel um Pharmakokinetik (), Pharmakodynamik (Wirkung), Pharmakochemie und Zellbiologie geht, ist uns bewusst, dass dieses Review vermutlich nicht einfach zu verstehen ist. Hier sind also die wichtigsten Kernpunkte (nicht unbedingt in exakter Reihenfolge, wie im Preprint strukturiert) zusammengefasst:
Erstens – Nicht wirklich neu, nur anders.
LNPs sind komplexere Formulierungen, die jedoch den Liposomen ähnlich sind. Das heißt, es gibt verschiedenste Formulierungen aus verschiedensten Lipiden in bestimmten Verhältnissen. Oder einfacher in einem Bild ausgedrückt: Auch wenn das Prinzip bei allen Formulierungen sich ähnelt, hat jeder Ingenieur dieser Technologie seine speziellen Zutaten und Mengenverhältnisse, die jedes Mal das Gesamtrezept völlig verändern. Das heißt, dass das Verhalten ebenso variiert wie einzelne Werte, wie beispielsweise das Zetapotential, welches die Außenladung der LNPs / Liposome definiert, und die Säurekonstante pKa, die das Base-Säureverhältnis sowie die Zytotoxizität beispielsweise bestimmt.
Prinzipielle Struktur von LNPs (Payload, der Inhalt, ist variabel)
Zweitens– Die Herstellung
Die Herstellung ist das Produkt. Traditionelle Medikamente werden hergestellt und haben immer eine halbwegs erwartbare Reaktion, weil bestimmte Wirkstoffe bestimmte Reaktionen an bestimmten Zelltypen / Geweben bewirken. Daher ist dort die genaue Zusammensetzung, selbst wenn sie minimal abweicht aufgrund von Herstellungsungenauigkeiten, nicht so ein Problem (solange die Prozessierung ordnungsgemäß ohne Verunreinigungen oder ähnliche Ausnahmefälle abläuft).
- Mayer, Peter F.(Autor)
Doch bei LNPs verhält es sich anders: Die einzelnen Lipide werden zusammen mit dem genetischen Material gemischt. Bereits kleinste Abweichungen, beispielsweise in den Fettsäureschwänzen, bestimmen über die Wirkung in vivo (das heißt im Körper).
Die Herstellung bestimmt das Zetapotential (siehe Drittens). Darüber hinaus schaffen es maximal ungefähr 50 Prozent des genetischen Materials überhaupt in die LNPs.
journey of a lipid nanoparticle
Drittens – Das ADME-Modell
Das traditionelle ADME-Modell versagt. Das traditionelle pharmakologische Modell Absorption (Aufnahme), Distribution (Verteilung), Metabolismus (Stoffwechsel) und Exkretion (Ausscheidung), kurz ADME, ist nicht dazu konzipiert, ein Produkt zu verfolgen, welches 4 Layer der Distribution und Absorption durchläuft. LNPs sind konzipiert um im gesamten Blutkreislauf zu zirkulieren. Und hier kommt die Einmaligkeit der LNPs ins Spiel:
Der erste Layer (die erste Ebene) ist die Zirkulation als solche. Bereits bei der Verteilung durch das Muskelgewebe in den Blutkreislauf (was sehr schnell erfolgt) ist die Instabilität der LNPs zu beachten. LNPs werfen beim Zirkulieren bereits PEGylierte Lipide ab, weil diese, zur Stabilisierung gedachten Lipide, durch Scherkräfte, Van-der-Waals-Kräfte und ähnliches beim Zirkulieren instabil werden. PEGylierte Lipide können Komplementaktivierungsartige Zustände hervorrufen, die zu anaphylaktischen und/ oder Immunüberreaktionen führen können.
Der zweite Layer ist ebenfalls in der Zirkulation zu betrachten. Während der Zirkulation bildet sich eine – vorrangig durch das Zetapotential definierte – Proteincorona. Das heißt, in vivo zirkulierende Antikörper und Proteine, wie beispielsweise Vitronectin, können an das LNP binden, wodurch die Oberflächenstruktur eine einmalige und heterogene Verformung annimmt. Diese wiederum ist darüber entscheidend, wie lange, wo und in welchen Zellen das LNP aufgenommen wird (dies wird Transfektion genannt). Die Transfektion kann Immunzellen betreffen.
Wir legen genau hier eines unserer Hauptaugenmerke drauf: Denn die nur zu gerne vereinfachte Phrase „LNPs gelangen überall hin“ ist zu verkürzt, zu versimplifiziert und wird der eigentlichen Sprengkraft dieser „Es sind doch nur Fettbällchen“-Technologie nicht im Entferntesten gerecht. Wie beschrieben, können LNP Immunzellen (beispielsweise dendritische Zellen, Monozyten, B-Zellen und T-Zellen) transfizieren, doch darüber hinaus – und das ist der Haken an dieser Technologie – kann ein LNP durch die erwähnte Proteincorona auch in diverse Gewebe eindringen.
Gewebe sind der Zusammenschluss von Zellen und deren einzelnen Strukturprodukten. Durch Transzytose (Membrantransport) und fenestriertes Epithelialgewebe (Auskleidungsgewebe mit Fenstern) können LNPs auch in diverse Gewebe, wie Hirn, Milz, Niere, Leber, Herz etc. gelangen. Dort kann das LNP weitere Zellen, wie Nierenzellen, Cardiomyozyten, Sternzellen und viele weitere transfizieren. Zusätzlich ist es nicht auszuschließen, dass auch bei der Transzytose und/oder Fenestration Epithelzellen transfiziert werden.
Auch wenn das Zetapotential aktuell ein umstrittenes Thema ist, da nicht genau bekannt ist, wie stark dieses in vivo bei ionisierbaren Lipiden ausgeprägt ist, bestimmt es über die Proteincorona.
Warum sind diese Details bereits so wichtig? Jede transfizierte Zelle erfährt unweigerlich Zellmembranveränderungen, die wiederum das ganze Zellverhalten beeinflussen könnten. Es ist sehr viel spekulativ, da viele Untersuchungen nie ausreichend in vivo in möglichst menschenähnlichen Modellen (wie Humanprimaten und/oder Schweinen) für die in BNT162b2 (BioNTech/ Pfizer) und mRNA1273 (Moderna) genutzten LNP-Formulierungen durchgeführt wurden.
Der dritte Layer ist der endosomale Escape. Der endosomale Escape beschreibt, ob die Payload, das heißt das in LNP verpackte genetische Material (zur Erinnerung: maximal 50 Prozent), es in das Zytosol (Flüssigkeit im Zellinneren) zur Translation (Generierung von (Spike-) Proteinen) schafft oder nicht. Dieser ist stark von der Formulierung und Proteincorona abhängig. Es wurde mehrfach bestätigt, dass nur drei bis maximal zehn Prozent des genetischen Materials es zu diesem Escape schaffen.
Doch was ist mit dem Rest? Auch diese Frage scheint eher durch zellbiologische Plausibilität und daraus abgeleitete Überlegungen hypothetisch beantwortbar, denn durch belastbare Daten belegbar.
Es gibt zwei Möglichkeiten: Die LNPs verweilen im Endosom/Lysosom (, was zu endosomal-lysosomalen Störungen führen kann. Oder, in einfachen Worten: Die Transportvesikel und der gesamte Recyclingkomplex, der normalerweise nicht verwertbare und wiederverwertbare Moleküle/Proteine in ihre Bestandteile spaltet, wird überstrapaziert, da die einmal ionisierten, kationisch ionisierbaren Lipide der LNP-Formulierung nicht entladen werden. Oder das gesamte LNP wird ungespalten in Exosomen verpackt und ausgeschieden. Dann zirkuliert es weiter und wird von weiteren Zellen aufgenommen und ein ähnlicher Prozess wird auch in dieser Zelle erneut gestartet. Dies geschieht vorrangig in der Leber. Das heißt also, die Exosomen legen eine weitere Reise in der Blutzirkulation bis zur Leber zurück.
Der vierte Layer ist die Biodegradation (Abbau). Anders als im ADME-Modell geschieht dieser ebenfalls in den Zellen.
Und genau das ist der Punkt, wieso die Herstellung das Produkt ist. Im Gegensatz zu traditionellen Medikamenten werden die LNPs nicht direkt in der Leber abgebaut, sondern in den Zellen. Selbst wenn sie in die Leber gelangen.
Es ist unklar, wie dies geschieht. Was jedoch klar ist und von führenden Publikationen bestätigt wurde, ist, dass selbst die Abbauprodukte bioreaktiv sind (reagieren auf biologische Prozesse).
the endosomal escape
Viertens – Die Blackbox
Es ist mit den aktuellen Untersuchungsmethodiken – selbst mit Atomic-Force-Untersuchungen und Cryo-TEM – nicht zuverlässig möglich, „in die LNPs zu schauen“. Das heißt, wir wissen weder, wie das genetische Material verpackt ist, noch wie genau es sich auf die LNP-Formulierungen auswirkt.
Darüber hinaus wissen wir auch nicht, wie sich sogenannte Lipid-Addukte bilden. Lipid-Addukte sind Lipide, die sich mit bestimmten Bindungsmotiven der modRNA verbinden. Dies wurde in vitro (im Reagenzglas) zwar mehrfach demonstriert, aber wir wissen gar nichts darüber, wie es sich in vivo (im Körper) verhält. Was macht diese Addukte so einmalig?
(a) Sie liefern ein falsches Signal, welches als DNA interpretiert werden könnte.
(b) Sie wirken unglaublich stabilisierend auf die modRNA, und es ist nicht bekannt, ob sie überhaupt wieder zu lösen wären.
(c) Es ist nicht bekannt, sollte sich in vivo diese Möglichkeit bestätigen, wie sich dies auf die Translation (Übersetzung als Prozess) und die daraus gebildeten Proteine strukturell, funktionell und in Bezug auf die Halbwertszeit auswirken würde.
Dies sind die wichtigsten Punkte, die wir in unserem narrativen Review (das heißt die aktuellen Erkenntnisse anhand der existierenden Lektüre überprüfend und zu einer Synthese zusammenführend) aufgreifen.
In unserem Review diskutieren wir darüber hinaus noch weitere Schwierigkeiten. Beispielsweise gibt es keine einheitliche Erfassungsmethodik für all diese Mechanismen, da jede LNP-Formulierung ihre eigenen „Tücken“ birgt. Es wurde kein Standardmodell für die Zulassung etabliert. Darüber hinaus wurden keinerlei „drug-interventions“, das heißt Interaktionen der LNPs und/ oder Zellreaktionen in Kombination mit anderen Medikamenten(Wechselwirkungen) untersucht. Es gibt weiters Verunreinigungsprobleme, Pufferprobleme, Stabilitätsprobleme und vieles mehr.
Wir hoffen, dass wir mit dieser Nussschale ein wenig die Komplexität näherbringen können und zeigen, wie unser Paper zu lesen und zu verstehen ist – sprich, eine kleine Einleitung liefern, wie viele pharmakologische Studien zu lesen sind und wie generell wissenschaftliches Wording verstanden werden sollte.
Artikel zur Studie: Neue Studie zu Lipid-Nanopartikel im Impfstoff: Russisches Roulette im Körper
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Hat man eigentlich untersucht, was dadurch passiert, dass der polare Anteil des LNP-Lipids positiv geladen ist und der des Membran-Lipids negativ? Dadurch, dass diese beiden unterschiedlichen Bausteine sich gegenseitig anziehen, müsste doch die Eigenschaft der Biomembran beeinträchtigt werden. Gerade die wichtige Fluidität ist für die intra- und extrazellulären Transportvorgänge der Zelle wichtig. Oder werden die LNP-Lipide abgebaut nachdem die LNPs ihren Inhalt abgegeben haben? Was ich allerdings für unwahrscheinlich halte-
Die LNP’s geben nicht so einfach ihren mRNA-Inhalt nach der Transfektion mit der Zelle in das Innere ab. Die formulierte mRNA wird also nicht in das Zytoplasma hinein katapultiert. Die Fettkügelchen drücken die Zellmembran in das Zytosol hinein, sodass erst eine Kugel sich bildet die sich dann im Zytosol befindet. Diese Kugel nennt man Endosom. Im inneren der Kugel werden an der inneren Kugelhaut die Toll-Like Rezeptoren tätig, da in der Kugel jetzt nur noch die mod-mRNA herumschwebt. Das sind Sensoren die jetzt prüfen, was dort rumschwebt. Zum Bsp. regieren auf Fremd mRNA-Stränge die TL7/8 darauf, die dann Boten an den Zellkern schicken und die dazugehörigen Genexpression startet. Die so erzeugten mRNA’s müssen jetzt am Ribosome im Zytosol die Proteine für die Gegenwehr erzeugen. Alles sehr komplex.
Das Endosom löst/öffnet sich aber zwischenzeitlich dann im Zytosol/Zytoplasma auf, sodass die mod-mRNA dann freigelegt vorliegt. Dort reagieren dann ebenfalls Sensoren auf die Fremd-mod-mRNA’s, können diese jedoch durch die Uracyl Modifizierung in ein N1-Pseudouridin (Karikó Erfindung) nicht erkennen. Der ganze freigelegt Mist der synthetischen mod-mRNA wird nun zum Spike-Protein translatiert und dort aber auch noch fehlerhaft Frame-Shift (Falschablesung, Übersprung).
Von mod. mRNA Bruchstücken kann keine Rede sein u. die Darlegung ist falsch. Eine mRNA verbindet sich vor Beginn der Translation immer mit dem PABP (Poly-A-bindendes Protein) das Schwanzende mit dem Anfang. Also der 5´-UTR-Anfang liegt über das PABP direkt neben dem 3´-UTR-Ende. Ist kein Schwanzende mit mindestens 5 A’s (Adenine) an der mRNA vorhanden, wegen Bruch, wird garnicht erst translatiert und die mod. mRNA über RNasen abgebaut.
Das dumme ist nur, man möchte jetzt gern wissen, wie die LNP’s in der Zelle abgebaut werden und wenn nicht, welche toxischen Reaktionen darauf resultieren. Die schaffen die Erklärungen nicht, über die Zerhackung über das Proteasom bzw. die vorherige Markierung von Fremdstoffen und dann weiter über das Lysosome, der Magen der Zelle. Mein Eindruck ist, es wird nur oberflächlich über alles mögliche herum diskutiert, hat aber nix konkretes durch Studien im Labor nachgewiesen. Also blanke Theorie !!!!!!
Sie zeigen gerade, dass Sie weder unsere Arbeit lasen noch die Kernaussagen mitgenommen haben. Dass ich, in einem für Laien zum Verstehen gedachten Artikel, nicht auf Details wie TLR7/8 eingehen kann, erklärt sich von selbst.
Und ihr Scheinwissen mag sich auf frühere Publikationen beziehen, nicht aber auf jüngste Publikationen.
So schreiben Packer et al. beispielsweise:
„Although LNP technology is an effective route for mRNA delivery to tissues, the interaction of certain chemical functionalities during storage such as oxidation, hydrolysis, or transesterification can lead to mRNA degradation19,20 through backbone cleavage of the mRNA into smaller fragments.“
https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC8608879/
Bitte lesen Sie zunächst unser Review, prüfen dann die von uns referenzierten 190 Papers und Dokumente und versuchen Sie dann sachlich zu argumentieren. Vieles, da stimme ich Ihnen zu, ist Theorie. Aber vieles bereits erwiesen.
Weitere Gedanken:
Erst einmal ist Ihre Darstellung des endosomalen Escapes komplett falsch. Durch den Protonschwamm kommt es zu endosomaler Disruption. Das heißt es bilden sich Poren, die dann Löcher in das Endosom reißen. SO und nicht anders wird modRNA in das Zytosol entlassen und bereits das hat extreme inflammatorische Konsequenzen via GAL9 und NRP3.
Und auch Ihre Äußerung, dass die Bruchstücke einfach von den RNasen degradiert würden, ist grundlegend falsch, da eine unglaubliche RNase-Persistenz durch die N1-Methylpseudouridin-Modifikationen zu erwarten ist.
Vllt. ist es Ihnen entgangen, aber sowohl der POLY-A von BNT162b2 als auch der von mRNA1273 wurden stark modifiziert um eben eine vorzeitige Degradation zu verhindern.
Darüber hinaus verkennen Sie die Möglichkeit von IRES in den Fragmenten, die weder eine 5’CAP noch eine UTR benötigen und dennoch würde translatiert. Theorie? Vielleicht? Wurde es ausgeschlossen? Nicht experimentell! Und genau diese Forschungslücken sind das echte Problem!
Korrektur: NLRP3 und Protonenschwamm.
Pardon für die Flüchtigkeitsfehler.
Nur bedingt untersucht. Es ist evident, dass bereits leere LNPs das Immunsystem aktivieren und neu funktionalisieren (epigenetisches Shifting). In unserer auf momentan noch im Feinschliff befindlichen Folgearbeit werden wir exakt diese Konsequenzen aus Sicht der Membranstrukturierung untersuchen. Dazu beleuchten wir auch im Detail die Ursprungsidee, die in Organellen synthetisierten TLRs ( insbesondere 3,7/8) mittels der modRNA zu supprimieren.
Das beantwortet nicht meine Frage. Egal wie die modRNA freigesetzt wird, die Umhüllung der Exosome und/oder LNPs „löst“ sich auf. Auflösen bedeutet aber, dass sie in ihre Grundbausteine LNP-Lipide oder Membranlipide zerlegt werden. Diese Universalbausteine (zumindest die natürlichen Membranlipide) können jetzt in jede Biomembran eingebaut werden. Also z.B. in die Kernmembran, ER, Umhüllung der Exosome u.s.w.. Das nennt sich Membranfluss. Wo bleiben also die LNP-Lipide?
Genau das ist die richtige Frage.
Diese werden wir in unserer Folgearbeit auch genau betrachten. Da die Membranstörungen der vermutlich initiale Zünder für alle weiteren Folgekaskaden sein werden (sowohl durch die Transfektion als solche – egal ob in Immunzellen oder Gewebe/ Organzellen), als auch die endosomale Ruptur als auch die weitere Zirkulation in Exosomen und erneute Aufnahme.
Ich kann schon mal soviel verraten: Es ist seit der Liposomtechnologie evident, dass es zu massiven Membranumstrukturierungen kommt.
Und soviel schon mal vorne weg: Es war den Herstellern egal. Es gibt keine ausreichenden Untersuchungen. Nur Hypothesen (in vitro und in vivo teilweise unterlegt aber problematisch wegen methodischer Schwächen) und biologische Plausibilität, wenn man beispielsweise der DSPC Degradation folgt und die 0:18/0:18 Phospholipide betrachtet.
Wichtige Zitate aus unserer Hypothese zu Ihrer Frage:
Aus der 4. Sektion:
„Our review of existing omics analysis reveals cell homeostasis affecting properties of LNPs that go beyond the traditional toxicological effects, particularly through their ionizable lipid components and, as we will discuss in our last section, DSPC and cholesterol as well. One limitation that should be considered is that there are no data available on the use of empty LNPs in humans alone. It is therefore unclear to what extent synergistic, additive, and antagonistic effects need to be considered. Simonsen and Schoenmaker et al. reported that only 30–50% of LNPs actually succeed in containing and delivering genetic material [220,221]. This is another important observation that strengthens our hypothesis. However, since these minimally loaded LNPs or eLNPs have been shown to exhibit greater fusogenicity, endosomal escape efficiency, and gene expression in vivo, it is possible these “empty LNPs” could engage or overload the ESCRT machinery, affecting endolysosomal homeostasis and downstream signaling [222].
„However, in vitro and in vivo data demonstrate that lipid formulated constructs, such as liposomes and LNPs, disrupt cellular homeostasis by altering signal transduction pathways, receptor activation, and phosphorylation cascades [9,135,223-225]. An autophagy deficiency might also appear, triggering apoptosis as one of the moderate downstream consequences, underscoring the broader toxic impact of LNPs. This finding is of considerable significance, as the omics data we have discussed here and the shifts in signaling pathways cannot be attributed solely to the presence of modRNA and/or spike proteins.“
Und weiter schreiben wir:
„Building on the role of lipid rafts in receptor localization and oligomeric clustering described by Fallahi-Sichani and Linderman [241], it has been suggested that these membrane microdomains also play a critical role in mediating interactions with exogenous particles. Wang et al. highlight that the ordered structure of lipid rafts can facilitate interactions between LNPs and the cellular membrane, thereby enhancing intracellular uptake through endocytosis [242]. Furthermore, the specific organization of these domains may mimic natural raft structures, improving recognition and internalization processes regulated by lipid rafts. Since lipid rafts organize receptor clusters and serve as platforms for regulated signaling and endocytosis, phosphatidylinositides emerge as key intracellular messengers and spatial organizers within these microdomains. Their composition and dynamic turnover help coordinate receptor localization, membrane trafficking, and downstream signaling events, highlighting their central role in understanding how LNPs may influence cellular homeostasis.“
(….)
„In Section 2, we also discussed that only 3% – maximum 15% of cargo-containing LNPs (depending on the formulation and cell type) actually reach the phase of endosomal/lysosomal escape [25]. Furthermore, Paramasivam et al. showed that the efficiency of endosomal escape does not correlate with overall uptake, indicating that the fraction of LNPs reaching endosomes is largely independent of how efficiently they later escape into the cytosol [82]. In other terms, that means that it is not known how many LNPs are taken up and how many stay in the endosomal/lysosomal/autophagosome transition.
Recent spatiotemporal analyses using sensitive LNP labeling platforms further support this notion, showing that continuous endocytosis and endolysosomal trafficking are required to maintain pools of releasable compartments, thereby mechanistically explaining why only a fraction of LNPs achieve cytosolic release while the remainder remains in lysosomes [254]. This partial efficiency highlights the unresolved question of how the remaining LNPs, which do not induce endosomal rupture and are trafficked to lysosomes, are subsequently degraded or recycled within the cell, and whether their presence might disturb these important processes.
Lipid nanoparticles (LNPs), upon endocytic uptake, introduce high local concentrations of cationic or ionizable lipids into the endosomal membrane, a phenomenon that has been highlighted as a major determinant of both efficacy and toxicity of LNP formulations [91]. Moreover, Jörgensen et al. suggest that even the biodegraded blocks of the protonated tertiary amines (ionizable lipids) like ALC-0315 and SM-102 remain bioactive. The authors note: “However, they are neither synthesized from endogenous or natural structures nor are they degraded into typical biocompatible building blocks” [91].“
Ich hoffe, das adressiert ausreichend Ihre Frage?
Liebe Grüße, Autor und Freigeist,
Falko Seger
ps.: Wir müssen leider noch kleine Referenzfehlerchen ausbügeln. Ich denke jedoch bei 306 Referenzen ist dies verzeihbar. V2. wird die Tage hochgeladen.
Man denkt tatsächlich, etwas in solchen Dimensionen im Griff behalten zu können…. nur von Hybris angekränkelte „Wissenschaftler“ glauben das…. war ja schon bei der Atombombe so.
Die Büchse der Pandora wird noch allerhand ausschütten in kommender Zeit…